การใช้งานของ qPCR แบบเรียลไทม์ qPCR แบบเรียลไทม์แบบเรียลไทม์ PCR

2023-07-17

Real Time Pcr

การใช้งานของ qPCR PCR แบบเรียลไทม์แบบเรียลไทม์ PCR แบบเรียลไทม์เกี่ยวข้องกับขั้นตอนต่อไปนี้:

1. การเตรียมตัวอย่าง: แยก DNA หรือ RNA จากตัวอย่างทางชีวภาพที่น่าสนใจ สิ่งนี้สามารถทำได้โดยใช้วิธีการต่าง ๆ เช่นการสกัดฟีนอลคลอโรฟอร์มการทำให้บริสุทธิ์ตามคอลัมน์หรือการทำให้บริสุทธิ์ด้วยลูกปัดแม่เหล็ก
2. การออกแบบไพรเมอร์และโพรบ: การออกแบบไพรเมอร์เฉพาะและโพรบที่จะผูกกับลำดับเป้าหมายที่น่าสนใจ โดยทั่วไปแล้วไพรเมอร์และโพรบเหล่านี้ได้รับการออกแบบโดยใช้เครื่องมือซอฟต์แวร์ที่พิจารณาปัจจัยต่าง ๆ เช่นอุณหภูมิหลอมละลายเนื้อหา GC และความจำเพาะ
3. การตั้งค่าปฏิกิริยา PCR: เตรียมการผสมปฏิกิริยา PCR โดยการรวมเทมเพลต DNA หรือ RNA ไพรเมอร์โพรบและส่วนประกอบอื่น ๆ ที่จำเป็นเช่นนิวคลีโอไทด์บัฟเฟอร์และพอลิเมอเรส การผสมปฏิกิริยาจะถูกกระจายไปยังหลุมของแผ่น PCR
4. Thermocycling: วางแผ่น PCR ลงในเทอร์โมไซเลอร์ 5 ช่องซึ่งสามารถรองรับตัวอย่างได้หลายตัวอย่างพร้อมกัน thermocycler จะผ่านชุดของวัฏจักรอุณหภูมิรวมถึง denaturation การหลอมและการขยายเพื่อขยายลำดับ DNA เป้าหมายหรือลำดับ RNA
5. การตรวจสอบแบบเรียลไทม์: Thermocycler 5 ช่องนั้นติดตั้งความสามารถในการตรวจจับการเรืองแสง ในแต่ละรอบอุณหภูมิ thermocycler ตรวจจับการเรืองแสงที่ปล่อยออกมาโดยโพรบที่ติดฉลากขณะที่มันผูกกับ DNA หรือ RNA ที่ขยายออก สิ่งนี้ช่วยให้การตรวจสอบกระบวนการขยายแบบเรียลไทม์
6. การวิเคราะห์ข้อมูล: ข้อมูลเรียลไทม์ฟลูออเรสเซนต์ถูกรวบรวมและวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์พิเศษ ซอฟต์แวร์คำนวณค่า Cycle Threshold (CT) ซึ่งแสดงถึงจำนวนรอบที่สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ข้ามขีด จำกัด ที่กำหนดไว้ล่วงหน้า ค่า CT ใช้ในการหาปริมาณจำนวนเริ่มต้นของ DNA เป้าหมายหรือ RNA ในตัวอย่าง
7. การตีความข้อมูล: ค่า CT ที่ได้จาก thermocycler 5 ช่องสามารถเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างที่แตกต่างกันหรือเงื่อนไขการทดลอง สิ่งนี้ช่วยให้การหาปริมาณของระดับการแสดงออกของยีนการตรวจจับการกลายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงหรือการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมหรือการวัดปริมาณไวรัสในหมู่แอปพลิเคชันอื่น ๆ
โดยรวมแล้ว qPCR PCR แบบเรียลไทม์ 5 ช่องทาง PCR เป็นเครื่องมือที่ทรงพลังสำหรับการใช้งานทางชีววิทยาโมเลกุลที่หลากหลายซึ่งให้ปริมาณกรดนิวคลีอิกที่รวดเร็วและแม่นยำ

ก่อนหน้านี้: การใช้งานการวินิจฉัยโมเลกุล Sanger Sequencing Machine ถัดไป: การใช้งานของ Thermocycler PCR เรียลไทม์ qPCR PCR Analyzer PCR